Способ, позволяющий отличить подлинно отрицательный результат ПЦР от технической ошибки при анализе, предложили специалисты Казанского государственного аграрного университета совместно с Федеральным центром токсикологической, радиационной и биологической безопасности. Исследование опубликовано в «Международном вестнике ветеринарии».
Почему отрицательный результат не гарантирует отсутствия возбудителя
Отсутствие сигнала при постановке ПЦР не всегда свидетельствует о том, что животное здорово. Реакция может не пройти, если клетки в образце разрушены не до конца, нуклеиновую кислоту — ДНК или РНК — выделить не получилось, либо в пробе сохранились соединения, препятствующие реакции. В подобной ситуации тест покажет отрицательный ответ, тогда как возбудитель в материале может присутствовать.
Контроль по генам самого животного
Для проверки хода анализа в диагностике применяют контрольный материал, который, как правило, вносят в пробу перед исследованием. Но такой вариант не даёт оценить самый первый этап — удалось ли разрушить клетки материала и извлечь из них нуклеиновые кислоты.
Авторы работы предложили в качестве контроля задействовать гены самого животного, изначально присутствующие в образце. Они проходят через все стадии обработки вместе с пробой, поэтому по ним можно судить, корректно ли подготовлен материал и прошла ли реакция.
Исследователи изучили восемь генов крупного рогатого скота, овец и коз и выявили в них участки, пригодные для такого контроля. На их основе разработаны праймеры и зонды — короткие последовательности, нужные для обнаружения выбранных участков. Для контроля ПЦР с обратной транскрипцией предложены участки генов бета-галактозидазы и нейраминидазы.
Как читать результат
Если ген животного в пробе найден, а генетический материал возбудителя отсутствует, отрицательный ответ можно считать более надёжным. Когда реакция не показала ни возбудителя, ни контрольный ген, результат нуждается в дополнительной проверке, а исследование, вероятно, придётся повторить.
Важно! Публикация описывает только первый этап разработки: генетические мишени подобраны, праймеры и зонды созданы, однако результатов их лабораторной проверки на биологических образцах авторы не приводят. Перед применением контроль нужно испытать в составе конкретных диагностических тестов.